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细胞转染和调控

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷 贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依 赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也 可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细 胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到 稳定转染的同源细胞系。

转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。

技术服务:

磷酸钙转染

磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法,磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞,被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞,不但适用于短暂表达,也可生成稳定的转化产物,但该法不适用于原代细胞。磷酸钙转染所需的DNA浓度较高,操作简便但重复性差。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,甚至偏离最优条件十分之一个pH都可能导致磷酸钙转染的失败。

脂质体转染

脂质体为人工膜泡,可作为体内,体外物质转送载体。将需转移的DNA或RNA包裹于质脂体,由于质脂体具有磷脂双层与胞膜相似,因此,可与细胞膜融合,将 DNA转入宿主细胞。影响转染效率差异的主要原因是细胞系间个体的差异,有的细胞系细胞膜通透性较好,质脂体复合物较容易进入细胞,转染效率就高。又有的细胞系本生就不容易被转染。其次脂类与DNA形成易于转染结构的特性存在负面效应。其中主要的问题是毒性,表现为细胞聚集在一起,从壁上脱落。另为脂质体转染易于受到血清中的脂肪与脂蛋白以及细胞外基质中带店成分,如硫酸软骨素等干扰引起细胞死亡从而影响转染效率。

客户方需提供:

1.生长状况良好的原代细胞、宿主细胞株,一并提供细胞特性,培养条件及相关注意事项。

2.我们也可以为客户代为购买细胞并且提供冻存保种服务,客户需要随时邮寄。

3.提供质粒,并说明质粒大小,浓度,抗性,拷贝数等相关背景资料。

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